線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1法）

產品概述 product description

線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）是利用JC-1探針檢測線粒體膜電位變化的試劑盒，可以快速靈敏地檢測細胞、組織或純化的線粒體膜電位變化，可以用于早期的細胞凋亡檢測。 本試劑盒染料JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential）△Ψm的理想熒光探針。與其他的陽離子染料如DiOC6(3)和羅丹明123相比，特異性更高，對線粒體膜電位變化的特異性高于質膜電位變化，對線粒體去極化檢測的檢測一致性更好；紅綠色熒光強度比率只受線粒體膜電位的變化，不受線粒體大小，形狀，密度的差異干擾；檢測靈敏度強，對細胞應激反應的微小異質性都能辨別。 JC-1有單體和聚合體兩種形式，兩者的發(fā)射光譜不同。JC-1單體(J-monomer)的最大激發(fā)波長為514nm，最大發(fā)射波長為529nm；JC-1聚合物(J-aggregates)的最大激發(fā)波長為585nm，最大發(fā)射波長為590nm。 JC-1可以透過細胞質膜進入細胞，以單體狀態(tài)游離于胞質內，正常健康細胞的線粒體的膜電位較高，具有極性，JC-1 依賴于膜電位的極性被迅速攝入線粒體的基質內，并因濃度增高而在線粒體內形成多聚體，多聚體488nm激發(fā)時的最大發(fā)射波長為590nm，發(fā)射光為橙紅色熒光，在流式圖上表現(xiàn)為FL1和FL2雙陽性；當細胞發(fā)生凋亡時，線粒體跨膜電位被去極化，線粒體膜電位較低，JC-1不能聚集在線粒體的基質中，從線粒體內釋放到細胞質，此時JC-1為單體，488nm激發(fā)時最大發(fā)射波長為527nm，可以產生綠色熒光，形成流式圖中細胞FL1為陽性。凋亡細胞則大多為FL1單陽性。這樣就可以非常方便地通過熒光顏色的轉變來檢測線粒體膜電位的變化。常用紅綠熒光的相對比例來衡量線粒體去極化的比例。 線粒體膜電位的下降是細胞凋亡早期的一個標志性事件。通過JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉變可以很容易地檢測到細胞膜電位的下降，同時也可以用JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉變作為細胞凋亡早期的一個檢測指標。 貝博? BBcellProbe? 可以提供細胞凋亡、增殖、毒性、活性氧、細胞代謝、氧化應激、細胞膜流動性、膜通透性轉換孔、細胞耗氧率、細胞內pH、細胞粘附、細胞自噬等數(shù)百種檢測試劑盒產品。 貝博? BBcellProbe? 可以為您提供各種顏色的BBcellProbe? M系列、N系列、L系列、E系列、G系列等細胞膜、細胞質、細胞核、溶酶體、線粒體、內質網、高爾基體、骨架、微管等細胞、細胞亞結構熒光染色試劑盒產品，以及鈣離子、鈉離子、氬離子等各種熒光染色試劑盒產品。 貝博? BBcellProbe? 可以提供動物、植物、微生物、酵母、水產、家禽、獸類、土壤等樣本的各種生化指標檢測的數(shù)百種試劑盒產品。

保存溫度

-20℃ 避光

注意事項

1.開蓋前請離心。
2.開蓋后組份按要求條件保存。
3.拆封后請盡快使用完！

有效期

1年

檢測方法

1.流式細胞儀
2.激光共聚焦
3.熒光顯微鏡

適用樣本

1.懸浮細胞
2.貼壁細胞

產品應用

1.流式細胞儀
2.激光共聚焦
3.熒光顯微鏡

儀器準備

1.流式細胞儀或熒光顯微鏡或激光共聚焦
2.離心機
3.移液器
4.冰箱
5.冰盒

試劑準備

1.PBS 緩沖液（pH7.4，實驗室常用的10mM磷酸緩沖鹽溶液（1X））
2.或者HBSS（Hank's Balanced Salt Solution）

耗材準備

1.離心管
2.吸頭
3.一次性手套
4.鋁箔

使用方法

懸浮細胞
1. 收集樣本細胞以及陰性、陽性對照細胞。細胞數(shù)量在2-5X105個。
2. 用PBS洗滌細胞兩次。離心收集細胞。
3. 用500ul JC-1染色工作液將細胞重懸，37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育15-30分鐘。
4. 在4°C，300-500×g力離心間5分鐘，棄培養(yǎng)基，收集細胞。
5. 用冷PBS洗滌細胞兩次。
6. 用500ul PBS將細胞重懸。
7. 用流式細胞儀或熒光分光光度計檢測分析結果，或者用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察結果。

貼壁細胞
對于貼壁細胞，可以先收集細胞，重懸后參考懸浮細胞的檢測方法。


純化線粒體
1. 把配制好的JC-1 染色工作液再用JC-1孵育緩沖液(1×)稀釋5 倍。
2. 0.9mL 5倍稀釋的JC-1 染色工作液中加入0.1mL 總蛋白量為10～100ug的純化的線粒體。
3. 結果檢測。

組織樣本
組織樣本可以用玻璃勻漿器勻漿成單細胞懸液后按照細胞樣本的方法檢測。也可以用其他細胞懸液制備的試劑盒處理組織后檢測。

常見問題分析

1.陽性對照如何設置？
如果要制備陽性對照細胞，可以用去極化藥物羰基氰化物間氯苯腙CCCP作為誘導線粒體膜電位下降的陽性對照，按以下方法操作： CCCP加入到細胞培養(yǎng)液中，終濃度10uM，處理細胞20 分鐘。隨后進行線粒體膜電位的檢測。對于大多數(shù)細胞，通常10μM CCCP處理20 分鐘后線粒體的膜電位會完全喪失，JC-1 染色后觀察應呈綠色熒光;而正常的細胞經JC-1 染色后應顯示紅色熒光。對于特定的細胞，CCCP 的作用濃度和作用時間可能有所不同，需自行參考相關文獻資料決定。
2.如何判斷線粒體膜電位變化？
不能單獨用紅色或綠色熒光強度來判斷線粒體膜電位，而必須使用紅綠熒光的相對變化，即紅綠熒光強度的比值做為指標來判斷膜電位變化。
以細胞群的平均紅、綠熒光強度，計算紅/綠熒光強度的比值（Ratio），根據(jù)重復實驗數(shù)據(jù)，對Ratio進行統(tǒng)計，反映膜電位變化。
流式分析時，相對于正常對照，凋亡陽性處理的細胞群會往右下方發(fā)生移動，即紅色熒光減弱，綠色熒光增強，這表明陽性處理導致線粒體膜電位下降。