產(chǎn)品概述 product description
細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的基本特征之一，它在機(jī)體的胚胎發(fā)育、組織修復(fù)、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和一些疾病發(fā)生過程等方面起著十分重要的作用。 在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜中的磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。在體內(nèi)，巨噬細(xì)胞可以識(shí)別翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜表面的PS 從而將這些程序性死亡的細(xì)胞清除，因此凋亡過程中并不伴隨局部的炎癥反應(yīng)，而在細(xì)胞壞死的過程中則常常伴隨著炎癥反應(yīng)。 AnnexinⅤ是一種分子量為35-36kD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與細(xì)胞凋亡過程中翻轉(zhuǎn)到膜外的PS高親和力特異性結(jié)合。PS 外翻發(fā)生在細(xì)胞核破裂，DNA 片段化以及凋亡相關(guān)蛋白出現(xiàn)之前，這使得Annexin V 與PS 的結(jié)合成為凋亡早期的一種重要檢測(cè)標(biāo)志事件。
保存溫度
2-8℃避光
注意事項(xiàng)
1.開蓋前請(qǐng)離心。
2.開蓋后組份按要求條件保存。
3.拆封后請(qǐng)盡快使用完！
有效期
1年
檢測(cè)方法
1.流式細(xì)胞儀
2.激光共聚焦
3.熒光顯微鏡
4.熒光酶標(biāo)儀
適用樣本
1.懸浮細(xì)胞
2.貼壁細(xì)胞
產(chǎn)品特點(diǎn)
1.方便：可用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡檢測(cè)；
2.快速：1小時(shí)內(nèi)即可完成實(shí)驗(yàn)；
3.準(zhǔn)確：能準(zhǔn)確區(qū)分活細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞，并計(jì)數(shù)各群細(xì)胞的比例。
產(chǎn)品應(yīng)用
1.流式細(xì)胞儀
2.激光共聚焦
3.熒光顯微鏡
4.熒光酶標(biāo)儀
儀器準(zhǔn)備
1.流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡或激光共聚焦
2.離心機(jī)
3.移液器
4.冰箱
5.冰盒
試劑準(zhǔn)備
1.PBS 緩沖液（pH7.4，實(shí)驗(yàn)室常用的10mM磷酸緩沖鹽溶液（1X））
2.或者HBSS（Hank's Balanced Salt Solution）
耗材準(zhǔn)備
1.離心管
2.吸頭
3.一次性手套
4.鋁箔
使用注意事項(xiàng)
1.螺旋蓋微量試劑管裝的試劑在開蓋前請(qǐng)短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體收集至管底，避免開蓋時(shí)液體損失導(dǎo)致試劑量不夠用。
2.細(xì)胞處理需要小心操作,盡量避免人為的損傷細(xì)胞。離心力在不損失細(xì)胞的前提下盡可能小，重懸細(xì)胞是動(dòng)作要輕柔，避免多次反復(fù)的激烈吹打。不用渦旋振蕩器。
3.Annexin V-FITC（等）和Propidium iodide（等）是光敏物質(zhì)，在操作時(shí)請(qǐng)注意避光，盡量減少它們暴露在光下的時(shí)間。有必要時(shí)可以使用帶蓋子的冰盒或鋁箔紙避光。標(biāo)記后將細(xì)胞保持在避光環(huán)境中。移液過程中短暫暴露在光線下（<30秒）是可以接受的。
4.由于細(xì)胞凋亡是一個(gè)快速和動(dòng)態(tài)的過程，因此最好在染色后立即進(jìn)行分析。
5.使用Annexin V-FITC（等） 試劑盒檢測(cè)凋亡需要針對(duì)活細(xì)胞。不要固定細(xì)胞，固定操作會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生干擾。
使用方法
樣品染色：
1. 離心收集懸浮細(xì)胞。離心機(jī)約300×g力，2-8°C，離心時(shí)間5分鐘，棄培養(yǎng)基。
2. 用冷PBS洗滌細(xì)胞兩次。
3. 用400 μl 1X Annexin V結(jié)合液重新懸浮細(xì)胞，濃度大約為1×106 cells/ml。
4. 在細(xì)胞懸浮液中加入5 μl Annexin V-FITC染色液，輕輕混勻后于2-8°C避光條件下孵育15分鐘。
5. 加入5-10 μl 7-AAD染色液后輕輕混勻于2-8°C避光條件下孵育2-5分鐘。 6. 立即用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡檢測(cè)。
常見問題分析
實(shí)驗(yàn)過程中Annexin V染不上色或陽(yáng)性率偏低?？赡艿脑蛉缦拢?br>1. 用于檢測(cè)的流式細(xì)胞儀/顯微鏡設(shè)置不當(dāng)。調(diào)整使用正確的儀器設(shè)置。
2. 確定實(shí)驗(yàn)中的誘導(dǎo)劑是否能產(chǎn)生凋亡?？赏ㄟ^設(shè)定確切凋亡誘導(dǎo)效果的陽(yáng)性藥物對(duì)照來排除這一情況。
3. 細(xì)胞未啟動(dòng)凋亡。重新確定誘導(dǎo)后凋亡啟動(dòng)的時(shí)間點(diǎn)（時(shí)程實(shí)驗(yàn)）。
4. 細(xì)胞數(shù)量偏少。增加細(xì)胞數(shù)量。
5. 貼壁細(xì)胞消化不當(dāng)。Annexin V 跟PS 的結(jié)合需要Ca2+離子，結(jié)合液中含有Ca2+，EDTA 的消化會(huì)影響染色，建議使用無EDTA 的胰酶，或者消化后用PBS洗滌干凈。
實(shí)驗(yàn)過程中陽(yáng)性率偏高?？赡艿脑蛉缦拢?br>1. 用于檢測(cè)的流式細(xì)胞儀/顯微鏡設(shè)置不當(dāng)。調(diào)整使用正確的儀器設(shè)置。
2. 細(xì)胞本身活力太差。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)未經(jīng)誘導(dǎo)凋亡的對(duì)照細(xì)胞經(jīng)染色后AnnexinV+/PI+雙陽(yáng)性的細(xì)胞比例過高，造成這種結(jié)果的原因可能是細(xì)胞本身活力太差。建議用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)算細(xì)胞的活力，臺(tái)盼藍(lán)拒染的細(xì)胞應(yīng)大于95%。若活力偏低低，建議重新復(fù)蘇細(xì)胞，通常剛復(fù)蘇的細(xì)胞至少要傳代3 次以后才能進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
