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技術(shù)問題|抗體的常見問題和解答(一)

技術(shù)問題|抗體的常見問題和解答(一)

技術(shù)問題|抗體的常見問題和解答(一)
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    問:什么是抗體?
    答:抗體(英語:antibody),(免疫球蛋白不僅僅只是抗體)是一種由漿細(xì)胞(效應(yīng)B細(xì)胞)分泌,被免疫系統(tǒng)用來鑒別與中和外來物質(zhì)如細(xì)菌、病毒等的大型Y形蛋白質(zhì),僅被發(fā)現(xiàn)存在于脊椎動(dòng)物的血液等體液中,及其B細(xì)胞的細(xì)胞膜表面??贵w能識(shí)別特定外來物的一個(gè)獨(dú)特特征,該外來目標(biāo)被稱為抗原。


    問:多抗和單抗的區(qū)別?
    答:多抗是多個(gè)B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的針對多種抗原表位的多種抗體混合物,單抗是一個(gè)B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的針對一種抗原表位的的單一抗體。



    問:多抗較單抗的優(yōu)勢是什么?
    答:a.首次制備成本低廉,制備所需技術(shù)要求不高,制備周期短。

    b. 能識(shí)別一個(gè)抗原上的多個(gè)表位,可在IP等實(shí)驗(yàn)中獲得更好的結(jié)果。

    c. 多抗因?yàn)榘械鞍卓稍诙鄠€(gè)表位上結(jié)合不止一個(gè)抗體分子,有助于放大低表達(dá)水平的靶蛋白信號(hào)。

    d. 能識(shí)別出與免疫原蛋白質(zhì)具有高同源性的蛋白質(zhì),或者從非免疫原物種的組織樣品中篩選靶蛋白,例如當(dāng)未測試物種中的抗原性質(zhì)未知時(shí),有時(shí)會(huì)使用多克隆抗體。e. 可識(shí)別多個(gè)結(jié)構(gòu)域,即使原始抗原的一些空間結(jié)構(gòu)或者序列發(fā)生小變化或者部分抗原決定簇變化,仍可以識(shí)別抗原,因此有更大的適應(yīng)性。


    問:多抗較單抗的劣勢是什么?
    答:a.容易產(chǎn)生批次間的差異?

    b. 產(chǎn)生大量的非特異性抗體,有時(shí)可能在某些應(yīng)用里產(chǎn)生背景信號(hào)。


    問:單抗如何選擇?
    答:如果對抗體的特異性要求高,用量較大或需要長期使用一致的抗體,制備的抗體應(yīng)用要求多(WB/IP/IF/ICC等),可以選擇制備單克隆抗體。



    問:多抗如何選擇?
    答:多抗相比較單抗仍然有制備時(shí)間短、首次制備成本低的特點(diǎn),在一些情況下也是一種選擇。另外,在相同條件下,使用多抗可以提高檢測的靈敏度,對于豐度偏低的蛋白也更容易檢出。



    問:WB, IHC, IP/ChIP類型抗體有什么區(qū)別?
    答: WB:目前最常做的類型,WB識(shí)別的蛋白是經(jīng)過加熱變性之后都變成線性結(jié)構(gòu)的蛋白。

    IHC:兔疫組化中需要進(jìn)行固定一步, 固定是為了盡量讓細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)維持和原有的一致。這種化學(xué)物質(zhì)的固定使蛋白

    質(zhì)變性凝固,與天然狀態(tài)下的蛋白質(zhì)有了一定的區(qū)別,但是又不同WB中加熱變性變成了線性的結(jié)構(gòu)。

    IP/ChIP:這類實(shí)驗(yàn)是用抗體去結(jié)合生理狀態(tài)下的蛋白質(zhì),因此IP和ChIP的抗體最好使用純化的天然蛋白制作的抗體。


    問:目的蛋白分子量為何與實(shí)際不符?
    答:當(dāng)條帶所示的實(shí)際大小與理論有偏差時(shí),可能有以下原因?qū)е?蛋白發(fā)生如磷酸化、糖基化等翻譯后修飾時(shí)條帶會(huì)上移,蛋白發(fā)生剪切(如前體)時(shí)條帶會(huì)下移,蛋白存在不同的可變剪切體或亞型,強(qiáng)相互作用大分子存在時(shí)變性不徹底。


    問:多抗做WB檢測為何有雜帶?
    答:a. 從純化方式來看:采用ProteinA/G純化的多抗摻雜有動(dòng)物本身產(chǎn)生的對其自身抗原產(chǎn)生的抗體,這些抗體在檢測中會(huì)識(shí)別樣本中的蛋白而出現(xiàn)雜帶,可以采用抗原親和純化避免雜帶的產(chǎn)生。

    b. 從蛋白修飾來看:天然蛋白存在復(fù)雜的翻譯后修飾。這點(diǎn)可以通過信息學(xué)分析進(jìn)行解釋。

    c.從蛋白翻譯后加工來看:翻譯后蛋白前體經(jīng)切割可能會(huì)使部分蛋白分子量偏小,而天然組織中同時(shí)存在蛋白前體和切割加工后的蛋白,二者序列有相同部分,可能會(huì)產(chǎn)生雜帶。這點(diǎn)需要通過查閱與目的蛋白相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行了解。

    d.從同源家族蛋白來看:當(dāng)目的蛋白有同源家族蛋白時(shí),蛋白異構(gòu)體的存在可能會(huì)使分子量偏離預(yù)測分子量,因?yàn)樘烊粯颖局杏赏粋€(gè)mRNA不同的剪接方式進(jìn)行翻譯形成的蛋白產(chǎn)物也會(huì)有相同的抗原表位,同時(shí)被抗體識(shí)別時(shí)會(huì)產(chǎn)生雜帶。

    e. 從蛋白聚集形式來看:蛋白多聚體的形成,雖然還原條件可以抑制多聚體的形成,但是強(qiáng)烈的蛋白間相互作用在還原條件下也有可能不解聚導(dǎo)致條帶偏大。


    問:抗體做WB為何不識(shí)別內(nèi)源樣本?
    答:蛋白在天然樣本中的豐度太低,此時(shí)需要進(jìn)行富集或者過表達(dá)再進(jìn)行檢測。b. 如果豐度不低,單抗/多抗不識(shí)別內(nèi)源可能是該抗體識(shí)別的表位在天然蛋白中有修飾位點(diǎn),此時(shí)需要對蛋白進(jìn)行修飾位點(diǎn)的分析。


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